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凝膠層析分離的一般原理和操作方法

凝膠層析分離的一般原理和操作方法

一、目的要求:

1. 學習與掌握親和層析和凝膠層析分離的一般原理和操作方法。

2. 了解自動化純化設備基本組成和原理。

3. 了解親和吸附層析瓊脂糖、凝膠過濾葡聚糖的基本性質(zhì)。掌握組氨酸標簽蛋白的基本性質(zhì)和純化原理和操作;掌握緩沖液置換和脫鹽的原理和操作。

 

二、實驗概述(如右圖)

實驗步驟:

1. 樣品預處理:即通過超聲這種細胞破碎的手段,將在大腸桿菌E.coli中表達的重組的帶6個His標簽的綠色熒光蛋白釋放到相應的緩沖液當中,再通過離心,0.2微米濾膜過濾等去除細胞碎片和別的污染物;

2. 組氨酸標簽蛋白親和層析:HisTrapTMHP crude, 1mL預裝層析柱,進行親和層析,一步就可以達到90%左右的純度

3. 凝膠過濾層析脫鹽去除咪唑:HiTrapTM  Desalting 5mL預裝層析柱進行脫鹽,置換緩沖液

4. 電泳:對純化過的樣品的檢測。

三、設備以及試劑準備(試劑均使用化學純以上):

1. 儀器:核酸蛋白檢測儀HD系列、自動部分收集器BSZ\DBS系列、恒流泵HL系列

2. 樣品:EGFP原液

3. 層析柱:HisTrap HP 1ml, 1根;HiTrap Desalting 5ml,1根

4. 層析緩沖液

名稱

配方

體積

緩沖液A

親和結(jié)合緩沖液

脫鹽平衡和洗脫緩沖液

25mM 磷酸鹽緩沖液,150mM NaCl, 20mM 咪唑,pH7.4

250ml

緩沖液B

親和洗脫緩沖液

25mM 磷酸鹽緩沖液,150mM NaCl, 500mM 咪唑,pH7.4

100ml

去離子水

脫氣或負壓脫氣

500ml

層析柱保存緩沖液

20%乙醇


 

5. 注射器,燒杯,負壓脫氣瓶等實驗室常用容器

 

四、實驗內(nèi)容

1. 儀器和實驗準備:

所有緩沖液需要過0.2um膜過濾,負壓脫氣抽濾瓶脫氣,脫氣裝置如圖所示

樣品預處理:即通過超聲這種細胞破碎的手段,將在大腸桿菌E.coli中表達的重組的帶6個His標簽的綠色熒光蛋白釋放到相應的緩沖液當中,再通過離心,0.45 微米濾膜過濾等去除細胞碎片和別的污染物;用注射器吸取大于2ml樣品

將注射器內(nèi)的樣品從樣品環(huán)3號口推入,注意不要將氣泡推入樣品環(huán)(如右圖)。


TEL:13798128437

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